常见问答

1、最佳克隆位点选择？

答：在选择克隆位点时，应避免选择克隆位点上下游50 bp内有重复序列的区域。当克隆位点上下游25 bp区域内GC含量均在40%-60%范围内时，重组效率将达到最大。若高于70%或者低于30%，重组效率会受到较大影响。

2、无克隆长出或克隆数较少？

答：出现该情况，建议使用阳性对照，可排除试剂盒本身的影响，并进行进一步判定，主要有以下可能情况：

1）引物设计不合适：推荐【同源序列（15-25 bp）+完整的酶切位点+基因特异性扩增引物】，GC含量40% - 60%。

2）感受态细胞效率低：使用新鲜制备或妥善冻存的感受态细胞，确保其转化效率>107 cfu/μg。每次操作时可设置一组转化质粒的对照实验，以检测感受态细胞的转化效率。连接产物体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率。

3）线性化载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量，或者比例不佳：尽量按照推荐的量和比例配制重组反应体系。

4）线性化载体和插入片段扩增产物不纯，抑制反应：线性化载体和插入片段扩增产物未纯化，直接使用时，使用总体积应不超过反应体系体积的1/5，如20 μL体系不超过4 μL。建议线性化载体、插入片段扩增产物进行凝胶回收纯化，纯化产物溶解在ddH2O中。

3、出现较多假阳性

答：主要有以下可能情况：

1）载体线性化不完全：即使是痕量未完全酶切的载体也会产生很高的转化背景。可通过阴性对照检测载体是否线性化完全，优化酶切体系，提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物等都可以有效减少环状质粒残留。

2）插入片段扩增产物混有非特异扩增产物：建议：①优化PCR体系，提高特异性；②胶回收PCR产物；③鉴定更多克隆。

3）反应体系中混入了相同抗性的质粒：PCR扩增模板(载体或插入片段)为环状质粒时，若扩增产物直接用于重组反应，残留环状质粒模板会产生较高的转化背景。建议使用预线性化质粒作为扩增模板、扩增产物进行DpnI消化或扩增产物进行胶回收纯化。

4、菌落PCR无条带

答：主要有以下可能情况：

1）引物不正确：推荐使用载体的通用引物或至少使用一条通用引物进行菌落PCR检测。

2）PCR体系或程序不合适：没有目的条带也没有空质粒条带，建议优化PCR体系、程序；或者提取质粒，以质粒做模板PCR验证；或者进行酶切验证。

3）重组失败：没有目的条带，只有空质粒的条带，说明重组不成功，载体线性化不完全，建议优化酶切体系。